دانلود رایگان


تهیه پروتکل ریز ازدیادی و تولید نیمه انبوه دو - دانلود رایگان



دانلود رایگان به منظور بررسي ريزازديادي دو پايه پاکوتاه‌کننده گلابي OH×F40 و ‌FOX11،‏ سه آزمايش مجزا صورت پذيرفت. در آزمايش اول اثر سه نوع محيط كشت شامل (MS، QL و QLتغيي

دانلود رایگان
تهیه پروتکل ریز ازدیادی و تولید نیمه انبوه دو پایه پا کوتاه کننده گلابی OH×F40 و FOX 11چکيده
واژه هاي کليدي: ريزازديادي، پايه پاکوتاه کننده گلابي، ریشه زایی، محيط کشت و پرآوري.
فهرست مطالب
عنوان صفحه
مقدمه:
گلابي يکي از درختان ميوه مهم مناطق معتدله محسوب مي‏شود و اگرچه تکثير آن به طرق مختلفي امکان پذير است، ولي معرفي عملي‏ترين و اقتصادي‏ترين روش تکثير آن مستلزم شناخت همه روش‏هاي ازدياد از جمله روش‏هاي تکثير درون شيشه‏اي است (روزبان و همکاران، 1381). اين گياه بومي آسياي غربي و اروپاي شرقي مي باشد (Nee et al., 2002). گلابي معمولي يا گلابي اروپايي از گونه communis مي باشد که ميوه هاي آبدار با دانه هاي سنگي و اغلب شکل کشيده دارد، اما گلابي آسيايي شکلي شبيه به سيب دارد (Potter etal., 2007).گلابي از حدود يک هزار سال پيش از ميلاد مسيح در يونان زير کشت در آمده و در حال حاضر، پس از سيب، مهم ترين ميوه دانه دار دنيا و ايران به شمار مي آيد (Jules and James, 1996). تعداد گونه هاي جنس Pyrus هنوز به طور کامل و دقيق مشخص نيست، اما تاکنون 60 گونه در اين جنس معرفي شده است (Krichkov and Potanov, 1998) که اکثر آن ها بومي آسيا يا اروپا و فاقد ميوه خوراکي مي باشند و تنها به عنوان پايه اي براي گلابي معمولي به کار مي روند، که بيست و شش گونه شناخته شده از جنس گلابي و پراکنش جغرافيايي آنها در جدول 1-1 آورده شده است. 11 گونه مختلف از جنس Pyrus در ايران وجود دارد (Westwood and Bjornstad, 1971، خاتم ساز 1371). گلابي از ميوه هاي دانه دار به شمار مي آيد (Jules and James, 1996). کليهگونه هايجنسگلابيدرمنطقهمعتدله نيمکرهشماليدنيايقديمپراکندهشده اند (Tatarintseva, 1981). کليهارقاموژنوتيپ هايگونهPyruscommunisدر 5 زيرگونه و در 5 منطقه، حوالي قفقاز (اوستيا و گرجستان) آسياي ميانه، اروپاي غربي، اروپاي شرقي و اروپاي جنوبي قرار گرفته اند. علاوه بر اين گروه، ارقام و ژنوتيپ هاي خاور دور از گلابي هاي (P. ussuriensis Maxim, P. calleryana و P. betulifolia ) منشاء گرفته اند (Krichkov and Potanov, 1998). گلابي معمولي (Pyrus communis) در منطقه قفقاز، روسيه، آسيا، اروپاي جنوبي و مرکزي پراکنده شده است (Kolesnicova, 1997). اينگونهازلحاظ مقاومتزمستانه،اندازهدرختوديگرصفات مورفولوژيکيوبيولوژيکيدارايتنوعبسياربودهو تصوربرايناستکهتعدادبسيارزياديازارقام تحتکشتدرآسيا،قفقازواروپاازاينگونهبوجود آمده است (Krichkov and Potanov, 1998). ژوکوفسکي معتقد است، منطقهقفقازوبخش هايغربيايرانيکيازاولين مراکزتنوعگونه هاوارقامتحتکشتگلابياست (Jookovskiy, 1950). گلابي هايآسياوآسيايصغيربهعنوانپايه بکاربردهمي شوندنهبهعنوانرقمقابلمصرف (Chalices and westwood, 1973 and Westwood, 1971 ). در انواع وحشي گونهPyrus communis قدرترشدبسيارزياداستکهمي تواندمنبعبا ارزشيبهعنوانپايهبرايارقامتحتکشتباشد (Kolesnicova, 1997).
جدول 1-1- بيست و شش گونه شناخته شده از جنس گلابي و پراکنش جغرافيايي (Krichkov and Potanov, 1998)
amygdaliformis
Pyrus
armeniacifolia
Pyrus
boissieriana
Pyrus
bourgaeana
Pyrus
calleryana
Pyrus
communis
Pyrus
cordata
Pyrus
cossonii
Pyrus
dimorphophylla
Pyrus
elaeagnifolia
Pyrus
fauriei
Pyrus
gharbiana
Pyrus
glabra
Pyrus
hondoensis
Pyrus
koehnei
Pyrus
korshinskyi
Pyrus
mamorensis
Pyrus
nivalis
Pyrus
pashia
Pyrus
pseudopashia
Pyrus
pyrifolia
Pyrus
regelii
Pyrus
salicifolia
Pyrus
syriaca
Pyrus
ussuriensis
Pyrus
xerophila
Pyrus
شاخه برخي از ارقام گلابي خاردار بوده، برگ هاي اره اي و مضرس با حاشيه صاف دارند. گل هاي گلابي هم زمان با برگ ها ظاهر مي شوند و روي گل آذين ديهيم قرار مي گيرند. معمولاً اکثر گونه هاي گلابي خودناسازگار بوده و نياز به ارقام گرده زا دارند. درخت گلابي در برابر سرما حساس تر از سيب بوده و مي تواند تا 30- درجه سانتي گراد را تحمل کند (خوشخوي و همکاران، 1377). در ضمن گونه هاي مختلف گلابي گرماي تابستان را نيز تحمل مي کنند و تابستان هاي خشک در کنترل بيماري آتشک[1] که گلابي به آن بسيار حساس مي باشد، مناسب است (Jakson, 2003).
برخلاف پايه هاي سيب که همگي از گونه Malus pumila مي باشند، پايه هاي گلابي از چندين گونه متفاوت Pyrus بوده و حتي تعدادي از آن ها به جنس ديگري متعلق مي باشند. گلابي حداقل 3000 سال است که در چين کشت مي شود، در قسمت هاي ديگري از دنيا، گلابي هاي زراعي از گونه P. communisبدست آمده اند (Davarynejad et al., 2007). کشت گلابي در تمدن غرب اولين بار توسط هومر حدود سه هزار سال پيش شرح داده شده است.
بدون شك اولين گونه اي كه اهلي شده Pyrus pyrifolia بوده است، زيرا تيپ وحشي آن بدون انجام گزينش، خوراكي است (Jakson, 2003). گونه هاي گلابي را براساس خصوصيات گياه شناسي و پراكنش جغرافيايي مي توان به پنج گروه طبقه بندي نمود که شامل، گونه هاي اروپايي، گونه هاي آفريقاي شمالي، گونه هاي غرب آسيا، گونه هاي آسيايي با ميوه بزرگ و گونه هاي آسيايي با ميوه كوچك مي باشند (Bell et al., 1996).
مهم ترين ارقام بومي گلابي در ايران شامل: شاه ميوه نطنزی، محمدعلي مشهد، سه فصله کرج، گلابي دم کج کرج، سبري و پيغمبري می باشند. گلابي را شاه ميوه يا آمرود هم مي نامند و به ميوه هاي پيوندي و شاداب آن شاه آمرود گويند (شکل 1- 1). همچنين از گلابي هاي خارجي نيز که کم و بيش در ايران کشت مي شوند مي توان ، بارتلت[2]، دوشس[3]، ویلیام دوشس[4]، لوئیزبون[5]، اسپادونا[6] و کوشیا[7]را نام برد. بارتلت که در اروپا بنام ويليامز مشهور است (شکل 1- 2)، مهم ترين و پرکشت ترين گلابي در دنيا به شمار مي رود (محمودزاده و ابراهيميان، 1390).
شکل 1- 1: چهار رقم از مهم ترين ارقام گلابي بومي ايران a. گلابي شاه ميوه b. گلابي شاه ميوه نطنز c. گلابي دم کج کرج d. گلابي بيروتي
شکل 1- 2: دو رقم از مهم ترين ارقام گلابي خارجي که در ايران کشت مي شوند. a. گلابي بارتلت b. گلابي دوشس

بالا بودن هزينه‏هاي توليد، يکي از عمده‏ترين مشکلات بخش کشاورزي، در راه توليد و صادرات محصولات به بازار‏هاي جهاني محسوب مي‏شود. توليد و تکثير نهال، يکي از بخش‏هاي مهم صنعت ميوه‏کاري هر کشوري به شمار مي‏رود و اساس باغ‏هاي خوب هر کشوري از بذل توجه به اين بخش نشات مي‏گيرد. در باغداري روز دنيا، ايجاد باغ‏هاي يکنواخت، علاوه بر سيستم تک کشتي، هم اندازه بودن درختان باغ، رسيدن همزمان ميوه‏ها، کاهش اندازه درخت، مقاومت به آفات و امراض و زودباروري درختان، بسيار مورد توجه مي باشد. براي نيل به اين اهداف، روش‏هاي مختلف کشت بافت، امروزه به عنوان يکي از ابزار‏هاي مطمئن و کارآمد، مورد توجه و اهتمام توليد‏کنندگان نهال در سراسر جهان قرار گرفته است (صفاري، 1378).
کشت بافت روش نوين و مهم در ازدياد گياهان است که در حال حاضر در دسترس پرورش دهندگان قرار دارد (صفاري، 1378). تكثير درون شيشه اي اين امكان را فراهم مي نمايد كه در طول سال به پايه هاي مورد نياز براي استفاده در خزانه دسترسي داشته باشيم (خوشخوي، 1377). ژرم‏پلاسم گلابي تكثير شده در محيط استريل، به دليل عاري بودن از عوامل بيماري زا، با اطمينان كامل از سدهاي قرنطينه كشاورزي كشورهاي مختلف قابل تبادل خواهند بود (Shibli et al., 1997). ارقام و گونه هاي مختلف گلابي هر يك داراي خصوصياتي هستند كه باعث گرديده از آنها به عنوان پايه، پيوندك، تزئيني و يا دومنظوره استفاده گردند. از ارقام و گونه هايي كه موجب بهبود كيفيت رشد درختان گلابي مي گردند به عنوان پايه استفاده مي شود. زودرسي، پاكوتاه كنندگي، تاثير روي عملكرد و كيفيت ميوه، بهبود مقاومت به آفات و بيماري ها و كمك به سازگاري با خاك هاي مرطوب و آهكي از جمله شاخصه هاي ارقامي مي باشد كه به عنوان پايه استفاده مي شوند (رسول زادگان، 1370).
مقايسه کلي بر وضعيت باغ­هاي سيب و گلابي در کشور ايران نشان دهنده اين است که برخلاف باغ هاي سيب، در باغ­هاي گلابي استفاده از پايه­هاي پاکوتاه کننده و روش­هاي کشت متراکم چندان متداول نشده است. مسلماً مهم ترين دليل اين امر عدم وجود پايه­هاي مطلوب و سازگار با شرايط اقليمي- خاکي بر ارقام گلابي کشور بوده و به اين ترتيب که پايه­هاي رويشي گلابي که طي 30 سال گذشته وارد شده همگي متعلق به گونه Cydonia oblonga مي باشند که اين پايه­ها حساس به کلروز و خاک­هاي آهکي بوده و با برخي از ارقام گلابي نظير گلابي ويليامز داراي ناسازگاري است، علاوه بر اين که در سرماهاي شديد زمستانه آسيب ديده و از بين خواهد رفت که اين معايب سبب توسعه محدود اين پايه­ها در کشور شده است. همچنين پايه‏هاي پا‏كوتاه كننده گلابي كه متعلق به گونهP. communis L. مي‏باشند و داراي سازگاري بسيار خوبي با ارقام تجاري هستند، را مي توان از طريق روش‏هاي کشت بافت با سرعت بالايي تکثير و عرضه نمود. تعداد محدودي از پايه‏هاي پا‏كوتاه كننده گلابي حاصل از کشت بافت به كشور وارد شده است. با توجه به اين که پايه‏هاي پا‏کوتاه کننده گلابي به تکثير از طريق ريزازديادي پاسخ داده اند، در حال حاضر يکي از اصلي‏ترين روش‏هاي تکثير آن ها کشت بافت محسوب مي‏شود (نصرتي، 1382). بر اين اساس با تلاش دهه هاي اخير در ساير کشورها نظير ايتاليا و آمريکا براي دستيابي به پايه­هاي مطلوب تري که فاقد معايب فوق باشند، دو پايه FOX11و OH×F40 وارد کشور گرديده است. اين پايه­ها که متعلق به گونه گلابي مي باشند، داراي محاسن متعددي شامل تحمل بهتر به غرقاب، خشکي و خاک­هاي آهکي بوده و با هيچ يک از ارقام گلابي ناسازگاري نشان نمي دهند. استفاده از اين پايه­ها سبب کاهش هزينه برداشت و هرس مي شود، همچنين کاهش مبارزه با بيماري آتشک با استفاده از بهبود مديريت باغ­هاي متراکم خواهد شد (روزبان، 1380). از اين رو پژوهش حاضر به منظور تهيه پروتکل انبوه پايه­هاي پاکوتاه کننده گلابي OH×F40 وFOX11 با ميزان ريشه­زايي بالا از طريق تعيين موارد ذيل صورت پذيرفت. شامل الف): ارزيابي اثر محيط‏هاي پايه مختلف ب): ارزيابي اثر غلظت‏هاي مختلف سايتوکينين نظير2iP و BAP ج): ارزيابي توان ريشه‏زايي پايه­هاي پاکوتاه کننده گلابي OH×F40 و FOX11
موفقيت در تحقيق فوق مي تواند به توليد و تکثير نيمه انبوه پايه­هاي پاکوتاه کننده گلابي OH×F40 و FOX11 و تامين هسته­هاي اوليه اين پايه­ها براي انجام طرح­هاي تحقيقاتي و حفظ در شرايط خارج از شيشه کمک کند.
1-2- گياه شناسي گلابي:
برگ هاي درخت گلابي اره اي مضرس هلالي يا با كناره صاف و به ندرت كنگره اي، جوانه ها در داخل از پهنا پيچيده و دمبرگ ها داراي گوشوارك هاي كم و بيش بزرگي مي باشند و فلس جوانه روي هم خوابيده و گل ها همزمان يا كمي قبل از جوانه هاي برگ باز مي شوند (عبداللهي، 1388). گل ها خوشه اي، چترمانند، سفيد به ندرت در برخي گونه ها و يا ژنوتيپ هاي وحشي صورتي و يا رگه هاي صورتي رنگ در آنها مشهود است. كاسبرگ ها به عقب برگشته يا گسترده و گلبرگ ها داراي قاعده دمبرگ مانند مي باشند. گلبرگ ها تا حدودي مدور تا مستطيلي پهن بوده و 20 تا 30 پرچم را در بر گرفته اند. بساک ها قرمز تا ارغواني و 2 تا 5 خامه آزاد در قاعده به وسيله ديسك يك‏جا جمع مي شوند. تخمك ها به تعداد دو عدد در هر خانه و ميوه پوم كروي تا گلابي شكل است و كاسه گل پايا يا خزان كننده و گوشت ميوه وابسته به رقم يا ژنوتيپ درصدهاي متفاوتي را از سلول هاي اسكلروئيدي دارا مي باشند. بذور رسيده گلابي قهوه اي تا سياه و در برخي گونه هاي اين جنس بسيار بزرگ تر از بذر گلابي هاي اروپايي است (عبداللهي، 1385).
از نظر گرده افشاني و تشكيل ميوه، تقريبا همه ارقام گلابي خودناسازگار و دگرباورند. اگرچه بعضي از ارقام گلابي در برخي شرايط آب و هوايي توليد ميوه بدون بذر مي كنند، با اين وجود بهترين عملكرد هنگامي است كه درخت گرده زا در بين ارقام اصلي كشت شده باشد (Westwood, 1993). درخت گلابي در برابر سرما از سيب حساس تر است و گل هاي گلابي در بهار کمي زودتر از سيب باز مي شوند. به همين دليل بیشتر در معرض خطر سرماي بهاره قرار مي گيرند (عبداللهي، 1385) .در تابستان گیاه گلابی گرما را بیشتر از سیب تحمل می کند. گل و ميوه گلابي در انتهاي شاخه ها و اسپورهای دو ساله بوجود مي آيد، بنابراين هنگام هرس درختان بارور، بايد در حفظ اسپورها دقت کرد. ميزان محصول گلابي در باغ هاي معمولي به 45 تن در هکتار مي رسد و تعداد ارقام گلابي موجود در ايران حدود 120 نوع است (محمودزاده و ابراهيميان، 1390).
1-3 - ازدياد و تکثير گلابي:
در ازدياد پايه هاي گلابي سه روش استاندارد وجود دارد که مورد استفاده قرار مي گيرند که این سه روش شامل: الف): روش جنسي کشت بذر ب): خوابانيدن کپه اي شاخه در درخت به ج): چوب سخت می­باشند.
در موارد خاص براي ريشه دار کردن تيپ هايي که به سختي ريشه مي دهند از قلمه هاي ريشه يا پاجوش هاي ريشه مي توان استفاده نمود. قلمه هاي برگ دار را تحت شرايط ميست پس از تيمار با IBAريشه دار مي کنند. آماده کردن بذر بسياري از گونه هاي Pyrus براي سبز شدن نياز به خيساندن آن ها به مدت يک روز و سپس شستن کامل و استراتيفيکاسيون آن ها براي سرما دادن دارد.براي ازدياد سريع يک پايه، قلمه هاي ريشه را به قطر حدود 7/0 تا 5/1 سانتیمتر انتخاب، به صورت اسکنه با واريته پيوندک پيوند مي زنند. رقم پيوندک را براي ريشه دهي مي توان به روش قلمه چوب سخت يا برگ ازدياد نمود (محمودزاده و ابراهيميان، 1390).برخي از گونه ها مثل P. calleryanaو P. betulifolia با استفاده از قلمه برگدار که در اواسط تابستان انجام مي گيرد بهتر ريشه دار مي شوند. براي پيوند گلابي علاوه بر گونه هاي وحشي و اهلي آن، مي توان از به و زالزالک نيز، براي پايه، استفاده کرد که در اين صورت درختان پاکوتاه خواهند بود و براي جلوگيري از ناسازگاري پايه و پيوندک بايد از يک رقم مناسب گلابي براي ميان پايه استفاده کرد (عبداللهي، 1388). فاصله کشت برحسب نوع پايه و قدرت رشد آن، 7-10 متر در باغ هاي معمولي است، ولي در انواع پاکوتاه مي توان اين فواصل را به چهار متر بين رديف ها و دو متر روي رديف ها کاهش داد که اين کار باعث افزايش محصول نيز خواهد شد (محمودزاده و ابراهيميان، 1390). تمام ارقام گلابي، خودناسازگار هستند، بنابراين براي توليد ميوه کافي، بطور حتم نياز به درخت گرده زاي مناسب و کندوگذاري دارند. بعضي از ارقام گلابي، مانند بارتلت، در صورت گرمي هوا در هنگام گل دادن مي توانند از طريق بکرباري محصول کافي توليد کنند. از پايه هاي به اصلاح شده که شامل QA، QB و QC مي باشند به عنوان پايه هاي پاکوتاه کننده براي گلابي استفاده مي شود (نصرتي، 1382). در ضمن از پايه هاي بذري نيز مي توان استفاده نمود. در اين صورت درختان تنومند با رشد زياد حاصل مي آيند. در كانادا، نيوزيلند، آفريقاي جنوبي و شيلي از نهال هاي بذري ارقام تجاري نظير ويليامز و وينترنليس استفاده به عمل مي آيد و پايه هايي كه در آسيا مورد استفاده قرار مي گيرد از كشوري به كشور ديگر متفاوت است (نصرتي، 1382). از نهال بذري، P. pyrifolia اصولاً در ژاپن براي ارقام همان گونه استفاده مي شود. در تايوان گلابي هميشه سبز P. kawakamii عمده ترين پايه مصرفي مي باشد. در قسمت شمالي چين، نهال بذري P. betuliafolia به عنوان پايه براي ارقام هيبريد P. pyrifolia و P. ussuriensis به كار مي رود. در كشور ما نيز استفاده از پايه هاي بذري حاصل از كشت بذر ارقام تجاري بيش از پايه هاي وحشي مرسوم است. اين در حالي است كه در استان هاي شمالي كشور، عموماً از بذور پايه هاي جنگلي جهت پايه استفاده به عمل مي آيد (عبداللهي، 1388). ارقام مختلف گلابي به دليل ميزان بالاي هتروزيگوسي از طريق بذري به خوبي قابل تكثير نيستند. با اين حال در بسياري از كشورهاي جهان استفاده از پايه هاي بذري گلابي به صورت كامل منسوخ نگرديده است. در كشورهاي اروپاي شرقي، تايوان و هند استفاده از پايه هاي بذري گلابي هاي وحشي هنوز رايج است. معمولاً گلابي را روي پايه هاي انتخابي، پيوند شاخه يا جوانه مي زنند. گونه اروپايي P. communis به طور گسترده مخصوصاً در آمريكا شمالي به عنوان پايه مورد استفاده قرار مي گيرد. از هم گروه هاي درخت به (Cydonia oblonga L.) نيز به دليل قابليت پا‏كوتاه كنندگي آنها به عنوان پايه استفاده مي شود. اما پيوند آنها با همه ارقام گلابي سازگار نمي باشد (Bell et al., 1999). تكثير ارقام گلابي از طريق قلمه چوب نرم و سخت به دليل ريشه زايي ضعيف مشكل مي باشد (Hartmann et al., 1997). ريشه زايي مستقيم قلمه در برخي از گونه هاي گلابي گزارش شده است (Shibli et al.,1997). همچنين نشان داده شده است، كه امكان ريشه زايي برخي از ارقام گلابي مانند الدهوم[8] و بارتلت توسط قلمه چوب سخت يا قلمه هاي برگ دار تحت سيستم مه افشان منوط به تيمار آنها با تنظیم کننده رشد ايندول بوتيريك اسيد (IBA) وجود دارد (Bell et al., 1996). با اين تفاصيل، روشن است كه روش هاي كلاسيك تكثير رويشي گلابي، عليرغم دارا بودن مزاياي بسيار، معايبي مثل وابسته بودن به فصولي خاص از سال، مشكل آلودگي هاي ويروسي و نياز به مهارت خاص را دارا مي باشند.
1-4- کشت بافت گياهي:
کشت بافت گياهي به رشد مواد گياهي عاري از ميکروب در شرايط عاري از ميکروارگانيسم ها مانند محيط غذايي استريل در يک لوله آزمايش کشت بافت گياهي اطلاق مي شود که شامل کشت پروتوپلاست، سلول، بافت و اندام گياهي مي باشد (خوشخوي، 1377). در سال هاي اخير فنون کشت بافت گياهي به يک ابزار بسيار قدرتمندي جهت تکثير بسياري از گونه هاي گياهي تبديل شده اند. اين تکنولوژي با نظريه پردازي دانشمند آلماني، هابرلنت، در مورد توانايي تبديل يک سلول به موجود کامل[9]در اوايل قرن بيستم شروع شد. هابرلنت پيشنهاد کرد که فنوني جهت جداسازي و کشت بافت ايجاد شود و ادعا کرد که اگر محيط و تغذيه سلول هاي کشت شده تنظيم شود اين سلول ها مي توانند گياهان نرمالي را بوجود آورند. اولين کشت موفقيت آميز بافت هاي گياهي توسط وايت در سال 1934 انجام شد. در سال 1939 وايت اولين کشت موفقيت آميز کالوس هويچ و توتون را گزارش کرد. در سال 1957 يک مقاله کليدي توسط اسکوگ و ميلر منتشر شد در آن مقاله، آنها اظهار داشتند که اثرات متقابل بين مقدار اکسين ها و مقدار سيتوکينين ها تعيين کننده نوع رشد و تغييرات ريخت شناسي مي باشد. مطالعات آنها بر روي توتون نشان داد که نسبت بالاي اکسين به سيتوکينين باعث القاي ريشه زايي مي شود، در حاليکه عکس اين حالت توليد نوساقه را تحريک مي کند. متاسفانه اين الگوي پاسخ عموميت ندارد. عليرغم تغيير نسبت اکسين ها به سيتوکينين ها براي بدست آوردن يک ريخت خاص در بسياري از گونه ها موفقيت آميز بوده است. در حال حاضر مشخص شده که عوامل بسيار ديگري بر توانايي سلول ها براي تمايز و تبديل شدن به ريشه، نوساقه يا جنين موثر هستند. بزرگ ترين مشوق براي استفاده از فنون کشت بافت گياهي در تکثير بسياری از گونه ها ممکن است کار اوليه مورل روي تکثير ارکيده در سال 1960 و کار موراشيگ و اسکوگ در 1964 در ايجاد محيط کشت جديدي با غلظت بالاي نمک هاي معدني بوده باشد. علم گياه شناسي پايه، عامل بسيار مهمي در موفقيت آميز بودن فنون کشت بافت گياهي محسوب مي شود (فارسي و ذوالعلي، 1388).
کشت بافت و سلول گياهي به همراه روش هاي مهندسي ژنتيک از ارکان مهم فناوري زيستي به عنوان يکي از علوم پيشرفته دنيا به شمار مي آيند. با علم به اين موضوع که هر يک از سلول هاي گياهي تمايز نيافته توانايي تبديل شدن به گياه کامل را دارند، دريچه اي تازه پيش روي دانشمندان و محققان علوم زيستي گشوده شد، به نحوي که در مقايسه با روش هاي اصلاح سنتي گياهان، تسريع قابل ملاحظه اي در مدت زمان اجراي برنامه هاي اصلاحي به وجود آمد و امکان انجام تلاقي هاي بين جنسي را نيز فراهم نمود. علاوه بر اين نگهداري ذخاير توارثي، توليد گياهان عاري از ويروس و توليد گياهان هاپلوئيد از جمله کاربردهاي مهم ديگر کشت بافت و سلول گياهي مي باشند. همچنين روش هاي کشت بافت مبتني بر دو مرحله تمايززدايي و تمايزيابي است که انجام هر يک از اين مراحل به شرايط خاصي نياز دارد و بايد در محيطي عاري از هرگونه آلودگي صورت پذيرد که گاه باعث افزايش هزينه توليد مي شود. با اين وجود مراکز توليدي ساليانه ميليون ها نهال و گياه مختلف را از طريق روش هاي ريزازديادي به بازار عرضه مي کنند و فرآورده هاي زيستي متعددي نيز با استفاده از روش هاي کشت بافت توليد مي شوند (باقري، 1382). انواع روش هاي کشت بافت گياهي شامل، کشت پينه، کشت سوسپانسيون سلولي، کشت پروتوپلاست، کشت هاپلوييد، کشت جنين و اندام، باززايي و ريزازديادي می شود. كشت سلول و بافت گياهي، ابزاري مهم در مطالعات پايه و كاربردهاي تجاري است (شکل 1-3). در حال حاضر به عملياتي نظير كشت سلول ها، بافت ها و اندام هاي استريل و اجزاي آنها تحت شرايط مطلوب فيزيكي و شيميايي در آزمايشگاه، كشت بافت گياهياطلاق مي شود (باقري و صفاري، 1387).
استفاده از فن آوري كشت بافت براي تكثير رويشي گياهان يا ريزازديادي مهم ترين كاربرد تجاري اين فناوري است. با اين فن آوري مي توان از يك گياه ميليون ها گياه جديد، با كيفيت خوب و در زمان كوتاه توليد كرد.كشت بافت سلولي با ارائه تئوري سلولي در قرن 19 آغاز گرديد. اين تئوري عنوان مي كند كه سلول واحد ساختماني مستقل و عملي يك موجود است. كاربرد تجاري كشت بافت در سال 1960 در آمريكا با ريزازديادي اركيده آغاز شد (حسندخت، 1385).
در بسياري از گونه ها مي توان تشکيل اندام هاي گياهي مثل ريشه، نوساقه يا پياز را روي بافت هايي که در حالت عادي چنين اندام هاي را توليد نمي کنند تحريک نمود. بيشترین پتانسيل تکثير کلوني از طريق جنين زايي سوماتيکي انجام مي شود که طي آن يک تک سلول جدا شده و منفرد مي تواند ابتدا يک جنين و سپس يک گياه کامل توليد کند. تکثير نوساقه ممکن است که به چندين روش انجام شود، يا انتهاي ساقه يا جوانه ممکن است طويل شده و گره ها و ميان گره هاي جديدي توليد نمايد که با تقسيم آنها مي توان تعداد زيادي نوساقه به دست آورد. جوانه هاي جانبي روي ريزنمونه ممکن است نوساقه توليد کنند که روي خود اين نوساقه ها جوانه هاي ديگري را خواهيم داشت. اغلب اين جوانه هاي جانبي به سختي با چشم غيرمسلح قابل رويت هستند، اما در اکثر زواياي برگي طرح اوليه جوانه ها وجود دارد. نوساقه هاي طويل شده را يا مي توان در شرايط درون شيشه اي ريشه دار کرد و يا اينکه آنها را به عنوان ريزقلمه درنظر گرفته و در شرايط غيراستريل کشت نماييم. بعضي از اين نوساقه ها را مي توان جهت تکثير مجدد کشت قطعه قطعه نمود. نوساقه ها چه به صورت ريزقلمه و چه به حالت گياهک هاي ريشه دار پس از انتقال به خاک با تغييرات قابل ملاحظه محيطي مواجه مي شوند و در معرض تنش هاي شديد قرار مي گيرند، مگر اينکه از قبل پيش بيني هاي لازم به عمل آمده باشد. اغلب در کشت بافت اين مرحله به عنوان يک مرحله بحراني محسوب مي شود و مي تواند با تلفات سنگيني همراه باشد (پيري و نظريان فيروزآبادي، 1385).
شرايط درون شيشه اي شامل رطوبت نسبي بالا، عاري از عوامل بيماري زا تامين مواد غذايي در حد مطلوب، شدت نور پايين، تامين ساکارز و يک بستر جامد يا مايع است. گياهان توليد شده با اين شرايط سازگار شده اند. گياهک هايي را که در شرايط درون شيشه اي به دست آمده اند بايد با شرايط خارج سازگار کرد. با شل نمودن درب ظروف يا با افزايش غلظت آگار رطوبت نسبي شرايط درون شيشه اي را مي توان کاهش داد، با کاهش ميزان ساکارز و افزايش شدت نور در طي چند هفته قبل از انتقال گياهچه ها، مي توان سنتز کلروفيل و فعاليت هاي فتوسنتزي را تحريک نمود. بستري که گياهان درون شيشه اي به آن منتقل مي شوند، بايد توانايي حفظ رطوبت را داشته باشد و نيز از زهکشي خوبي برخوردار باشد. لازم نيست که خاک و محيط اطراف آن استريل باشد، ولي تحت شرايط رطوبت خيلي زياد رعايت اصول بهداشتي بسيار اهميت دارد. اگر تعداد گياهچه ها کم باشد مي توان آن را در داخل جعبه اي قرار داد که بتوان درب آن را بتدريج حذف نمود. ابتدا جعبه را در سايه قرار داده و سپس به تدريج آن را در معرض نور معمولي مناسب براي گونه ها قرار مي دهند. ريزازديادي به عنوان يک تکنيک داراي کاربردهاي تجاري قابل توجهي است، زيرا با اين تکنيک مي توان تعداد زيادي واريته هاي گياهي جديد و پايه هاي گياهي عاري از بيماري توليد نمود. در حال حاضر اين تکنيک ها به خوبي مشخص شده اند و منابع بسيار، حاوي اطلاعات دقيقي در مورد کشت گونه هاي گياهي مختلف وجود دارد. همچنين در حال حاضر در استراليا شرکت هاي تجاري زيادي وجود دارند که از دستورالعمل هاي مفيد براي ازدياد گونه هاي گياهي استفاده مي کنند. اکثر اين موارد شرکت هاي کوچکي هستند و سود اندکي دارند، چنانچه سوددهي کشت بافت گياهي اصلاح شود توانايي تجاري خوبي دارد (سوهاني، 1379).
شکل 1- 3- شيشه هاي محتوي محيط کشت استريل و قطعات گياهي قرار گرفته در اتاقک رشد
به طور كلي امتيازهاي روش ريزازديادي شامل مواردی است که مهم ترین آنها عبارتند از اینکه، گياهان تكثير شده به روش كشت بافت از قدرت رشد بالايي نسبت به گياهاني كه به روش هاي سنتي تكثير مي شوند برخوردارند، ازدياد آن گروه از گياهاني كه با روش هاي سنتي به سختي تكثير شده و يا از نظر اقتصادي مقرون به صرفه نيستند، تكثير و توليد تعداد زيادي از كلون هاي با ژنتيك معينامکان پذير است، بذور از ريسك كم تري براي جوانه زدن برخوردارند، آزاد شدن از قيود اقليمي موجود از نظر فصل و زيستگاه و در تمام طول سال مي توان گياه توليد كرد، حمل و نقل مواد گياهي را راحت تر مي كند، نگهداري درازمدت و ميان مدت مواد گياهي امکان پذير است، تكنيك هاي كشت بافت در توليد گياهان عاري از ويروس، دستكاري ژنتيكي، هيبريداسيون سوماتيكي، اصلاح نباتات و مطالعات پايه استفاده مي شوند.
شکل 1-2- قفسه هاي حاوي شيشه هاي محيط کشت و قطعات گياهي در اتاق استريل رشد واقع در مركز پژوهش هاي بيوتكنولوژي خليج فارس
1-4-1- تعريف ريزازديادي:
ريزازدياي، عبارت است از توليد گياه با استفاده از قسمت هاي بسيار ريز گياه، بافت ها و سلول هاي گياهي، كه تحت شرايط استريل شده درون لوله آزمايش و يا ظرف هاي ديگري كه محيط و مواد غذايي آنها به دقت كنترل مي شوند، انجام مي گيرد. ريزازديادي يا کشت اندام، با يک بخش سازماندهي شده گياهي (اغلب يک جوانه) شروع مي شود و روند کشت بافت اين ساختار سازماندهي شده را حفظ مي کند، در حالي که رشد و نمو بعدي آن را به سمت تکثير و باززايي يک گياه کامل جديد هدايت مي کند. در کشت بافت اگر ريزنمونه ها از گياهان سالم و قوي تهيه شوند احتمال موفقيت بیشتر مي شود (فارسي و ذوالعلي، 1388). معمول ترين عضو مورد استفاده جوانه يا گره مي باشد، اما برحسب گونه گياهي و هدف موردنظر ممکن است از اجزاء ديگر گياه استفاده شود. صرفنظر از انتخاب فرم هاي مورد علاقه گونه ها، گرايش طبيعي براي کشت بافت، بالاخص تشکيل ريشه هاي نابجا نيز ممکن است قابل توارث باشد. استفاده از طيفي از والديني که از نظر ژنتيکي متفاوتند امکان پذير است. هر قدر که اندازه ريزنمونه کوچک تر باشد احتمال انتقال بيماري هاي درون زا يا تنوع ناشي از شيمر (در مواردي که شيمر وجود دارد) کمتر است، از طرف ديگر در ريزنمونه کوچک تر احتمال آسيب ديدن آن در طول عمليات کشت و همچنين احتمال عدم موفقيت در کشت اوليه بیشتر مي شود. کشت بافت بعضي گونه ها يا ارقام، راحت تر از بقيه است. معمولاً کشت بافت گياهاني که براحتي از طريق قلمه زني سنتي تکثير مي شوند ساده تر است و بالعکس. انتهاي ساقه ها و جوانه هاي در حال رشد بهترين ريزنمونه ها هستند. بایستی استفاده از ريزنمونه هايي که در تماس با خاک هستند اجتناب گردد، بخاطر اينکه احتمال آلودگي آنها زياد است. صرفنظر از آلودگي سطحي، بافت هاي گياهي ممکن است داراي ميکروارگانيسم هاي بيماريزا باشند، فقط بافت هاي سالم از انتهاي ساقه هايي با رشد فعال، آلودگي هاي کم تري دارند. ده ها سال است كه در آزمايشگاه هاي تحقيقاتي، قابليت رشد بافت هاي گياهي مانند كالوس و يا تعليق سلولي و اندام هاي گوناگون گياهي، مانند ساقه، گل، ريشه و جنين كم و بيش و به صورت نامحدود به عنوان ابزاري پژوهشي در دست متخصصين ژنتيك، باغباني، گياهشناسي و بيماري هاي گياهي مي باشد. روش هايي كه مورد استفاده قرار مي گيرند، به طور كلي كشت بافت ناميده مي شدند (حاج­نجاري، 1373). از آنجا كه ريزازديادي يكي از روش هاي تكثير غيرجنسي گياهان مي باشد؛ لذا مزيت آن در مقايسه با ساير روش هاي تكثير غيرجنسي و همچنين تكثير جنسي قابل بررسي مي باشد؛ به طوري كه همه مواردي كه براي كاربردهاي كشت بافت در قسمت هاي قبلي مطرح شد از مزاياي ريزازديادي مي باشد، با اين حال اين روش داراي معايبي نيز هست كه شامل، پرهزينه بودن، زيرا به امكانات و تجهيزات خاصي نياز دارد، نياز به نيروي متخصص دارد و تغييرات ژنتيكي و اپي ژنتيكي كه در حين كار به وجود مي آيند و باعث تغيير در ساختار گياه مي شوند.
به طور كلي از تمام قسمت هاي يك گياه براي استفاده در كشت بافت مي توان استفاده كرد. ريزنمونه ممكن است قطعاتي از برگ، ساقه، ريشه، در سيستم انتهايي ساقه يا ريشه، ميوه هاي كوچك، غنچه هاي گل يا مادگي و حتي يك سلول يا پروتوپلاست يك سلول باشد. از كشت هر يك از اين قسمت ها ممكن است بافتي به نام كالوس به وجود آيد، كه اين بافت از تعداد زيادي سلول هاي غيرتخصصي تشكيل شده است؛ اين بافت از تقسيم سلولي، سلول هاي بافت كشت شده به دست مي آيد. از بافت كالوس در ريزازديادي و كشت بافت استفاده زيادی مي شود و با ايجاد شرايط مناسب از آن گياه كامل به دست مي آورند، يا ممكن است از قطعه يا اندام كشت شده مستقيماً به شاخه زايي رسيد و بعد اين شاخه ها را به گياه كامل تبديل كرد (حاج نجاري، 1373).
1-5- انواع کشت بافت گياهي:
انواع روش هاي کشت بافت گياهي شامل کشت مريستم، کشت کالوس، کشت ريزازديادي، کشت سوسپانسيون و ساير کشت هاي ديگر مي باشد که در ذيل آورده شده اند (سوهاني، 1379).
  1. کشت مريستم:
اين اصطلاح اغلب به قطعات بسيار کوچکي که از جوانه هاي انتهايي يا جانبي نوساقه جدا مي شوند اطلاق مي شود (فارسی و ذوالعلی، 1388).
  1. کشت کالوس:
بافتي که از تکثير سازمان نيافته سلول ها به وجود مي آيد. معمولاً در ريزازديادي بهتر است که از تشکيل کالوس جلوگيري شود، به علت اينکه کالوس باعث ايجاد تنوع مي شود. اکثر کارهاي اوليه کشت بافت شامل کالوس توتون، هويچ، گل اطلسي و غيره بوده است که همه آنها جزء گياهان علفي بوده اند. هر ميليمتر کالوس از هزاران سلول تشکيل شده و هر يک از آنها توانايي تشکيل يک جنين را دارند، لذا نسبت تکثير مي تواند بسيار زياد باشد (باقری، 1382).
  1. کشت ريزازديادي:
ريزازديادي يا کشت اندام، با يک بخش سازماندهي شده گياهي (اغلب يک جوانه) شروع مي شود و روند کشت بافت اين ساختار سازماندهي شده را حفظ مي کند، در حاليکه رشد و نمو بعدي آن را به سمت تکثير و باززايي يک گياه کامل جديد هدايت مي کند (فارسی و ذوالعلی، 1388).
  1. کشت سوسپانسيون سلولي يا محيط کشت مايع:
سوسپانسيون سلولي از کشت کالوس تهيه مي شود کالوس که يک توده سلولي تمايز نيافته است وقتي که در محيط کشت مايع قرار گيرد، سلول هاي آن از هم جدا شده و سوسپانسيون سلولي را به وجود مي آورد (فارسی و ذوالعلی، 1388).
  1. کشت پروتوپلاست:
کشت پروتوپلاست را ممکن است مرحله بعدي کشت سوسپانسيون در نظر گرفت، به عبارتي با هضم ديواره سلول هاي تشکيل دهنده سوسپانسيون سلولي با آنزيم سلولاز، پروتوپلاست ها جدا مي شوند. در پروتوپلاست ها، محتويات سلولي توسط يک غشاء با تراوايي نسبي احاطه شده است. با حذف ديواره سلولي داخل نمودن مواد خارجي شامل مواد ژنتيکي پايه ( RNAو DNA)يا امتزاج کامل گونه هاي مختلف امکان پذير مي شود. مي توان اين سلول ها را با سلول هاي گونه هاي کاملاً متفاوت امتزاج داد (فارسی و ذوالعلی، 1388).
  1. کشت جنين نارس:
در بعضي موارد ناسازگاري بين گونه ها يا ارقام، بعد از تشکيل جنين اتفاق مي افتد و منجر به سقط جنين مي شود. چنين جنين هايي را در حالت نارس و قبل از سقط شدن مي توان خارج کرده و در شرايط درون شيشه اي آنها را رشد داد (فارسی و ذوالعلی، 1388).
  1. کشت اسپور سرخس:
کشت درون شيشه اي، شرايط رشد ايده آلي را فراهم مي کند، اما الگوي رشد همانند الگوي رشد در شرايط طبيعي است (باقری، 1382).
1-6- مزاياي کشت بافت گياهي:
توليد انبوه گياهاني با ساختار ژنتيکي يکسان معمول ترين مزيتي است که به کشت بافت گياهي نسبت داده مي شود، مهم ترين مزاياي کشت بافت گياهي شامل، تکثير سريع کلون ها، حتي با ريزازيادي ممکن است که از يک ريزنمونه تعداد بسيار زياد نوساقه جديد بوجود آيد که هر کدام از اين نوساقه ها را مي توان دوباره کشت کرده و از طريق يک ريزازديادي ديگر تعداد بسيار زيادي گياه جديد توليد کرد. با يک ضريب تکثير نسبتا کم، طي 9 نسل که 12ـ9 ماه طول مي کشد مي توان تقريبا 2 ميليون گياهچه توليد نمودT همچنین، يکنواختي ژنتيکيکه اين موضوع در جايي که نياز به يکنواختي گياه است و يا در جائيکه لازم است که مطمئن شويم که يک خصوصيت قابل توارث حفظ شده است حائز اهميت است، شرايط غيرآلوده زیرا حفظ کشت هاي گياهي تحت شرايط غيرآلوده يک منبع بزرگي از مواد گياهي عاري از بيماريزا را در اختيار ما قرار مي دهد.محيط کنترل شده، هنگامي که نگهداري کشت هاي گياهي در شرايط محيطي کنترل شده مدنظر باشد يا برحسب نيازهاي کشت (مانند گياهان مادري فوق الذکر) يا شايد براي ساير اهداف مانند ريشه دار کردن در گونه هايي که از اين نظر مشکل دارند کشت هاي درون شيشه اي در اينگونه موارد داراي مزاياي آشکاري مي باشند. حفظ و نگهداري منابع ژنتيکی، که نياز به فضاي کوچک و سهولت فراهم کردن شرايط مناسب موجب شده است که کشت هاي درون شيشه اي، روش کاربردي مناسبي جهت حفظ گياهان مادري کلکسيون ها محسوب شوند. از اين روش مي توان براي نگهداري گياهان زراعي، گونه هاي کمياب و گونه هايي که در معرض خطر هستند استفاده کرد. از فنون کشت بافت ممکن است جهت توليد گياهان هيبريد در گونه هاي ناسازگار، از طريق کشت جنين يا تخمک استفاده شود (فارسی و ذوالعلی، 1388).
استفاده از روش هاي كشت آزمايشگاهي بافت هاي گياهي، به منظور نگهداري ذخاير توارثي گياهي در سال هاي اخير به شدت رو به افزايش بوده است. دلايل اين امر عبارتند از، حمله حشرات و بيماري هاي گياهي، تغييرات ناگهاني شرايط اقليمي، كاهش و از دست رفتن قوه ناميه بذور، بالا بودن هزينه هاي كاشت، داشت و برداشت به منظور نگهداري و مسائل سياسي و اقتصادي اين روش در مورد بسياري از گونه ها تاكنون اجرا شده است، به طور مثال نيشكر، قهوه، كاكائو، سيب زميني كه كلكسيون جهاني ذخيره توارثي سيب زميني در مركز بين المللي تحقيقات سيب زميني (C.I.P) در كشور پرو مي باشد(باقري و صفاري، 1387). بانک ژن پسته در انگلستان كه تمام ذخاير ژنتيكي اين گونه را از سراسر جهان از جمله: افغانستان، شوروي سابق، ايران، جنوب ايتاليا، قبرس و آمريكا گردآوري كرده است قابل ذكر است (خوشخوي، 1377).
روش هاي نگهداري ذخاير توارثي گياهي از طريق كشت بافت نیز شامل، نگهداري در شرايط انجماد خشك، به طوري كه نمونه هاي گياهي در ازت مايع و در دماي 196 درجه سانتي گراد زير صفر براي مدت زيادي حفظ مي شوند و نگهداري مواد گياهي در شرايط حداقل رشد که در اين حالت نمونه ها در شرايطي قرار مي گيرند كه تقسيم سلولي در آنها به حداقل مي رسد و يا به طور كلي متوقف مي گردد، می شود (باقري و صفاري، 1387). براي نيل به اين هدف از روش هاي مختلفي استفاده مي شود كه عمده ترين آنها عبارتند از، الف) تغيير دادن شرايط فيزيكي كشت از قبيل دما و يا تركيبات گازي ظروف محتوي كشت، ب) تغيير دادن محيط غذايي پايه، از قبيل حذف و يا تغيير غلظت برخي از اجزاء محيط كشت و ج) افزودن مواد كندكننده رشد به محيط كشت كه سبب مي شود تعداد واكشت ها به يك بار در سال يا دو بار در سال كاهش يابد. موادي كه بدين منظور به كار مي روند عبارتند از، اسيدآبسزيك، مانيتول، سوربيتول، فسفون- دي، مالئيك هيدرازيد، سوكسينيك اسيد، سايكوسل. همچنین انبار كردن در دماي پايين، يكي ديگر از روش هاي بسيار مؤثر نگهداري بافت ها مي باشد. گونه هاي گياهي كه به اين روش نگهداري شده اند عبارتند از: مو، سيب زميني، سيب، توت فرنگي و چند گونه ديگر. به عنوان يك اصل كلي، بافت هاي گياهي نواحي معتدله در دماي صفر تا 6 درجه سانتي گراد و گياهان نواحي گرمسيري در دماي 15 تا 20 درجه سانتي گراد نگهداري مي شوند (حاج نجاري، 1373).
1-6-1- توليد گياهان هاپلوئيد:
در اصلاح نباتات گاهي ضرورت ايجاب مي نمايد كه گياهان هموزيگوت داشته باشيم و يكي از راه هاي توليد اين گياهان توليد گياهان هاپلوئيد است كه بعد با دو برابر كردن كروموزم ها مي توان به اين هدف نايل آمد و گياهان حاصله دابل هاپلوئيد هستند (حاج نجاري، 1373).
1-6-2- امتزاج پروتوپلاست:
سلول گياهي داراي ديواره سلولي مي باشد. حال اگر با روش هايي از جمله: روش مكانيكي و آنزيمي ديواره سلولي را از سلول جدا كنيم، باقيمانده را كه شامل غشاء سيتوپلاسمي و ضمائم سلولي مي باشد، پروتوپلاست گويند. گاهي به دلايلي از جمله ناسازگاري جنسي و يا فيزيكي امكان تهيه گياهان دورگه با روش معمولي نيست. لذا براي حل مشكل فوق و اصلاح درختان و گياهان زراعي از امتزاج پروتوپلاست ها استفاده مي شود. در حال حاضر از پروتوپلاست ها در ايجاد پيوند پروتوپلاسمي بين دو يا چند سلول و تهيه گياهان دورگ با كشت پروتوپلاست هاي امتزاج يافته، وارد كردن مواد ژنتيكي خارجي به داخل سلول از قبيل كلروپلاست، ميتوكندري، DNA، پلاسميد، باكتري، ويروس و غيره، مطالعه نحوه ترشح و ساخت ديواره سلولي در سلول هاي جدا شده و مطالعه مجموعه اي از پروتوپلاست ها به صورت يك سيستم سلولي واحد و در تمام موارد پس از ايجاد تغييرات لازم در سطح سلولي، براي كشت دادن، استفاده مي شود (پيري و نظريان فيروزآبادي، 1385).
1-6-3- ريزپيوندي:
ريزپيوندي به پيوندزدن قسمت كوچكي از يك گياه، مانند مريستم بر روي يك گياه ديگر گفته مي شود. از آنجا كه اين كار در آزمايشگاه و در شرايط عاري از عوامل بيماريزا صورت مي گيرد و از طرفي طول ريزنمونه هايي كه به عنوان پيوندك استفاده مي شوند كم تر از 5/0 ميلي متر مي باشد؛ براي رشد بعدي لازم است كه در محيط كشت مصنوعي رشد داده شوند؛ لذا مي تواند يكي ديگر از كاربردهاي كشت بافت باشد. ريزپيوندي به منظورهاي ذيل انجام مي گيرد:
  1. عدم تجانس احتمالي، بين پايه و پيوندك؛ كه اين وضعيت در شرايط آزمايشگاهي به سرعت پديدار مي شود، در حالي كه در شرايط طبيعي به 5 تا 10 سال وقت نياز دارد.
  2. كمك به گياهان مسن جهت تحريك بازگشت به دوره جواني.
  3. توليد گياهان عاري از ويروس، كه در اين حالت از مريستم به عنوان پيوندک استفاده مي شود (حاج نجاري، 1373).
1-6-4- توليد و استخراج متابوليت هاي ثانويه:
علاوه بر مواد شيميايي حاصل از فرآيندهاي دروني گياه كه در تمامي گياهان مشترك مي باشد، تركيبات شيميايي بخصوص در برخي از گياهان توليد مي شود كه توسط تعداد معدودي از گونه هاي گياهي و يا حتي رقم خاصي از يك گونه ساخته مي شوند. اين تركيبات خاص را متابوليت هاي ثانويه گويند و برخي از آنها عبارتند از: آلكالوئيدها، آنتي بيوتيك ها، روغن هاي فرار، رزين ها، تانن ها، گليكوزيدها، استرول ها و غيره. ضرورت توليد اين مواد توسط گياه، يا براي حفاظت از خود در مقابل حمله ميكروارگانيسم ها و جانوران مي باشد و يا براي افزايش توانايي گونه هاي گياهي در رقابت با ساير گونه ها مي باشد (فارسي و ذوالعلي، 1388). كاربرد كشت بافت در توليد و استخراج اين مواد عبارت است از:
- كشت و تكثير بافت ها و يا سلول هاي توليد كننده اين مواد و استخراج مستقيم متابوليت ها از آنها بدون ضرورت توليد گياه كامل، مانند استخراج مرفين از كشت كالوس.
- كشت و تكثير سريع گياهان توليدكننده اين مواد به منظور دارا بودن منابع توليد طبيعي.
- تسريع در ساخت اين مواد در بافت ها و سلول ها، از طريق افزودن پيش ماده هاي آنها
1-7- ترکيب محيط هاي کشت بافت:
در مورد وضعيت تغذيه و رشد در کشت بافت گياهي دو پارامتر يعني مقادير عناصر قابل دسترس و تعادل بين آنها وجود دارد. در کشت بافت همه عناصر ضروري که بطور طبيعي در خاک هستند را بايستي به نسبت هاي مساوي (در مقايسه با خاک) در محيط کشت قرار داد (خوشخوي و همکاران، 1377). قابليت استفاده از مواد غذايي تحت تاثير تعادل بين عناصر با pH محيط کشت قرار مي گيرد، وضع تغذيه اي گياه مادري هم ممکن است موثر باشد (خوشخوي و همکاران، 1377). در اکثر حالات کشت بافت، مخلوط استانداردي از عناصر پرمصرف و کم مصرف وجود دارد و فقط تغيير در غلظت هاي آنها مقايسه مي شود. گياهان به طور پيوسته به يک نسبت رشد نمي کنند. رشد بخش هايي از گياه ممکن است براي دوره اي آهسته و يا متوقف شود که معمولاً به اين دوره خواب گفته مي شود. در هر گياهي رشد بخش هاي مختلف ممکن است بطور همزمان يا غيرهمزمان باشد. مشخص ترين نماي اين حالت ريزش برگ ها و خواب زمستانه درختان برگ ريز مي باشد. درختان هميشه سبز نيز دوره خواب دارند، با اين تفاوت که درختان هميشه سبز همه برگ هايشان را از دست نمي دهند و در هر زمان بعضي از نوساقه ها به خواب مي روند، در حاليکه بقيه نوساقه ها در حال رشد هستند. حالت خواب ممکن است که در مراکز رشد بخصوصي مثل ساقه ها، ريشه ها، برگ ها و جوانه ها اتفاق افتد (خوشخوي و همکاران، 1377).
صرفنظر از اينکه نور منبع انرژي براي فتوسنتز است، اثرات مختلفي بر روي رشد گياه دارد، بالعکس حذف نور از گياه يا يک بافت بخصوص مي تواند بر روي فيزيولوژي آن تاثير بگذارد. تحت شرايط شدت نور کم يا تاريکي ميزان هيدرات کربن کاهش مي يابد. با تغيير در شدت دوره، يا کيفيت نور (رنگ يا طول موج)ميزان تنظیم­کننده های رشد درون زا يا ساير اجزاء فيزيولوژيکي گياه ممکن است تغيير کند. اين اثرات مي تواند بر روي گياه مادري يا در هر مرحله اي از کشت اتفاق افتد (خوشخوي و همکاران، 1377).
مهم ترين ترکيبات محيط هاي کشت بافت گياهي به شرح ذيل آورده شده است (حسندخت، 1385).
  • عناصر معدني:
تعداد 12 ماده غذايي معدني براي رشد گياهان ضروري هستند و همچنين گزارش شده که تعدادي ديگري هم در شرايط درون شيشه اي بر روي گياهان موثرند. جهت رشد نرمال در کشت بافت اين عناصر ضروري بايد در محيط کشت وجود داشته باشند.
  • عناصر غذايي آلي:
گياهان تحت شرايط طبيعي اتوتروف هستند و مي توانند تمام مواد آلي مورد نياز خود را سنتز کنند. عليرغم اينکه گياهان شيشه اي توانايي سنتز اين ترکيبات را دارند، ولي عقيده بر اين است که ميزان توليد بعضي از ويتامين ها براي رشد سالم کافي نيست و بايد يک يا چند ويتامين به محيط کشت اضافه شود. از ميان ويتامين ها افزودن تيامين به محيط کشت ضروري است و اسيد نيکوتينيک، پيريدوکسين و اينوزيتول نيز معمولاً به محيط کشت اضافه مي شوند.
  • منبع کربن:
گياهان در کشت بافت بصورت هتروتروفيک رشد مي کنند و قادر نيستند که مقدار کربن مورد نياز خود را در حد کافي سنتز کنند، لذا يک منبع کربن (معمولاً سازگار) بايد به محيط کشت اضافه گردد. منبع کربن علاوه بر تامين انرژي مورد نياز براي رشد گياه واحدهاي ساختماني براي توليد مولکول هاي بزرگ تر مورد نياز براي رشد گياه را نيز فراهم مي کند.
  • آگار:
بعضي از گياهان يا بافت هاي آنها در محيط کشت مايع کشت مي شوند. اين محيط کشت ممکن است ساکن باشد و يا اينکه معمولاً توسط يک همزن تکان داده شود. اکثر بافت ها روي محيط کشت جامدي کشت مي شوند که توسط آگار يا جانشين آن مانند ژالريت يا فيتاژل، ژله اي شده باشد.
  • :pH
pH محيط کشت معمولاً بين 6/5 تا 8/5 تنظيم مي شود، اما گياهان مختلف براي رشد مطلوب ممکن است به pHهاي متفاوتي نياز داشته باشند. معمولاً pH محيط کشت در زمان تهويه محيط کشت روي 5/5 تنظيم مي شود. pH محيط کشت مي تواند بر روي قابليت حل شدن عناصر غذايي، جذب آنها بوسيله مواد گياهي و سفت شدن آگار موثر باشد يا اينکه اثرات ريخت شناختي داشته باشد. معمولاً از تغييراتpHمحيط کشت در طول زمان و در هنگام اتوکلاو کردن چشم پوشي مي شود.
  • تنظيم کننده هاي رشد:
در اکثر محيط هاي کشت يک يا چند تنظيم کننده رشد افزوده شود.
  • آب:
در کشت بافت معمولاً از آب مقطر استفاده مي شود و بسياري از آزمايشگاه ها از آب دوبار تقطير شده استفاده مي کنند.
1-8- تنظيم کننده هاي رشد گياهي در کشت بافت:
تنظیم کننده های رشد ترکيبات آلي هستند که در بافت هاي گياهي ساخته مي شوند براي تاثير بر روي رشد و نمو گياه فقط به غلظت هاي خيلي کمي از آنها نياز است. مشخص شده است که بسياري از مولکول هاي آلي مصنوعي، فعاليت بيولوژيکي مشابه به تنظیم کننده های رشد گياهي دارند. به مجموعه ترکيبات مصنوعي و تنظیم کننده های رشد طبيعي، تنظيم کننده رشد اطلاق مي شود. کشت بافت، دستکاري رشد گياه در شرايط دقيقا کنترل شده است و اکسين ها و سيتوکينين ها از اهميت ويژه اي در اين دستکاري ها برخوردار هستند. اکثر ريزنمونه ها مقداري اکسين و سيتوکينين درون زا توليد مي کنند. در کشت بافت تنظيم کننده هاي رشد برون زا جهت تحريک رشد بکار برده مي شوند. براي استفاده از تنظيم کننده هاي رشد در محيط هاي کشت، محلول هاي مادري آنها در تاريکي و در يخچال نگهداري مي شوند (فارسي و ذوالعلي، 1388)
  • اکسين ها:
اکسين ها نقش هاي متفاوتي در رشد و نمو گياه دارند. آنها طويل شدن و رشد سلولي تقسيم سلولي، تشکيل کالوس و تشکيل ريشه هاي نابجا را تحريک مي کنند. اکسين ها همچنين از نمو جوانه هاي جانبي و تشکيل جنين هاي سوماتيکي بر روي کالوس جلوگيري مي کنند.
  • سيتوکينين ها:
سيتوکينين ها باعث تورم بافت ها، تحريک نمو جوانه هاي جانبي و نابجا و تحرک تقسيم سلولي مي شوند. در کشت بافت گياهي نقش سيتوکينين ها در تحريک نمو جوانه جانبي از طريق کاهش غالبيت انتهايي بسيار با اهميت است . سيتوکينين ها در حضور گرما پايدار هستند و ممکن است که قبل از اتوکلاوکردن به محيط کشت اضافه شوند.
  • اسيدجيبرليک:
اسيدجيبرليک را به ندرت در کشت بافت استفاده مي کنند اين تنظیم کننده های رشد در مقابل گرما ناپايدار است و نمي تواند اتوکلاو شود. بنابراين از طريق فيلتراسيون استريل مي گردد و بعد از اتوکلاو کردن محيط کشت به آن اضافه مي گردد عموما نقش اسيدجيبرليک تحريک جوانه­زدن بذر و تحريک رشد طولي ميانگره ها است (خوشخوي و همکاران، 1377).
  • اسيدآبسزيک:
اسيدآبسزيک ( (ABA بطور گسترده اي در بافت هاي گياهي وجود دارد و بعنوان يک بازدارنده رشد تلقي مي شود، از اينتنظیم کننده های رشد اغلب در کشت بافت استفاده نمي شود. اما کاربردهاي اختصاصي مثل تحريک نمو جنين از کالوس، دارد (خوشخوي و همکاران، 1377).
  • اتيلن:
اتيلن يک گاز با ساختمان ساده است و توسط گياهان توليد مي شود و اعتقاد بر اين است که تجمع آن در ظروف درب بسته کشت بافت از رشد جلوگيري مي کند. اتيلن در غلظت هاي بالاتر باعث تحريک پرآب شدن (شيشه اي شدن) بافت هاي گياهي مي شود.
  • آدنين:
آدنين مکررا به محيط کشت اضافه مي گردد و نشان داده شده که اثرات مفيدي بر روي توليد نوساقه دارد. با وجود اينکه فعاليت آدنين ناشناخته مي باشد، ولي چون پيش نياز سيتوکينين است، احتمالاً در سنتز عمده سيتوکينين نقش داشته باشد.
  • زغال فعال:
اين ماده در غلظت هاي بين 2/0 تا 3% در محيط هاي کشت استفاده مي شود. زغال فعال از طريق جذب، مي تواند مواد را از محيط کشت حذف کند. نقش تنظيم کننده هاي رشد بيش تر به درصد جذب آنها به وسيله زغال فعال نسبت داده شده است نه اثرات مستقيمي که آنها اعمال مي کنند. اغلب زغال فعال در محيط کشت القاء ريشه زايي استفاده مي شود.
1-8-1 چرخه هاي رشد گياه:
جوانه هاي گياه ممکن است رويشي يا زايشي (جوانه گل) باشند که به وضعيت آنها و چرخه رشد گياه بستگي دارد. جوانه هاي رويشي براي بسياري از اهداف ارجحيت دارند، به علت اينکه يک نوساقه جديد توليد خواهند کرد، بنابراين به اين طريق تعداد نقاط رشد زياد مي شود. حالت فيزيولوژيکي بافت هاي نوساقه در طول دوره گلدهي متفاوت است و اين مسئله مي تواند بر روي پاسخ به کشت بافت جوانه هايي که در آن زمان جمع آوري شده اند تاثير بگذارد. اغلب توصيه مي شود که در طي دوره گلدهي از تهيه قلمه يا مواد گياهي براي کشت بافت خودداري شود. همانند گلدهي، گياهان و جوانه ها يا بافت ها، دوره هاي فعاليت يا عدم فعاليت دارند و اين وضعيت هاي مختلف بر روي پاسخ به شرايط کشت اثر مي گذارد (حاج نجاري، 1373).
هدف از کشت بافت، کنترل شرايطي است که ريزنمونه در آن رشد مي کند تا اينکه بتواند رشد ريزنمونه را در جهت مورد علاقه تغيير دهد. رشد هر بافت يا اندام چه در کشت درون شيشه اي و چه به عنوان بخشي از يک گياه کامل نهايتاً توسط شرايط فيزيولوژيکي داخل بافت ها تعيين مي شود. گياه با تغيير شرايط فيزيولوژيکي داخل بافت به تغييرات شرايط رشد پاسخ مي دهد. بدنبال آن نتايج نهايي تغييرات حاصل از شرايط خارجي ممکن است تحت تاثير شرايط فيزيولوژيکي فعلي داخل بافت قرار گيرد، يعني الگوي رشد همچنانکه تحت تاثير شرايط داخلي و خارجي قرار مي گيرد در نهايت توسط حالت فيزيولوژيکي محض تعيين مي شود (حاج نجاري، 1373).
1-9- ايجاد کشت هاي عاري از بيماري:
آلودگي ممکن است بر روي سطح گياه، بين سلول ها و يا در داخل سلول هاي گياهي باشد. آلودگي هاي سطحي را مي توان با شستشو و تيمارهاي شيميايي مختلف برطرف نمود. ريزنمونه اوليه منبع عمده آلودگي می باشد، ولي احتمال وقوع آلودگي مجدد در هر مقطعي از مرحله کشت بافت وجود دارد (باقري، 1382). ابتدا محيط کشت و تمامي ظروف و لوازم بايد استريل شوند و سپس تمام کارها بايد در شرايط کاملاً بهداشتي انجام شود. هوا همانند بدن و لباس کارکنان، منبع اصلي اسپورها و ساير آلوده کننده ها به شمار مي آيد. کنترل ارگانيسم هايي که در داخل بافت هاي گياهي زندگي مي کنند مشکل تر مي باشد، با استفاده از آفت کش ها و قارچ کش هاي سيستميک بر روي گياهان مادري قبل از جمع آوري ريزنمونه ها يا استفاده مستقيم از آنها در کشت ها تا حدي مي توان آلودگي هاي درون زا را کنترل کرد. حذف ويروس به تيمارهاي اختصاصي تري نياز دارد و معمولاً مشاهده شده که بعد از چندين نسل کشت ظاهراً استريل، آلودگي نمايان مي شود (باقري، 1382).
ويروس ها معمولاً در داخل سلول هاي بافت گياهي باقي مانده و در طي تقسيم سلولي به سلول هاي جديد منتقل مي شوند، بنابراين آنها از طريق تکثير ويروس منتقل مي شوند. ويروس ها ممکن است تا زماني که گياهان در شرايط درون شيشه اي رشد مي کنند هيچگونه علائمي را نشان ندهند، ولي بعد از انتقال گياهان به محيط خارج علائم آلودگي هاي ويروسي نمايان شود. گرمادرماني روش اصلي حذف ويروس است. در شرايط رشد طبيعي به موازات رشد انتهايي ساقه، ويروس نيز به بافت هاي جديد منتقل مي شود. اگر گياه بتواند در درجه حرارت هاي بالا رشد کند در اينصورت ميزان همانندسازي ويروس ممکن است آهسته شود و در نتيجه انتهاي ساقه مي تواند سريع تر از ويروس رشد کند و عاري از ويروس باشد، سپس مي توان انتهاي ساقه را که عاري از ويروس است قطع نموده و آنرا کشت کرد (باقري، 1382).
1-10- محيط هاي کشت اوليه و شرايط کشت:
معمولاً بهتر است که براي اولين ريزنمونه ها از يک محيط کشت حاوي ساکارز و فاقد تنظیم کننده های رشد استفاده نماييم. اين موضوع باعث مي شود در مواقعي که تعدادي از کشت ها بر اثر آلودگي يا مرگ ريزنمونه ها (به دليل روش تهيه غلط) از بين مي روند، از هدر رفتن يک محيط کشت کامل و جامع جلوگيري شود. اکثر آلودگي هاي قارچي و باکتريايي در دو هفته اول مشخص مي شوند.اغلب کارهاي ريزازديادي در محيط هاي کشت نيمه جامدي انجام مي شود که از آگار يا اخيرا از ژلرايت جهت سفت کردن آنها استفاده مي شود. اين ژل ها نشيمنگاهي را براي ريزنمونه ها بوجود آورده و تهويه محيط کشت را افزايش مي دهند.ژلرايت يک فرآورده مصنوعي مي باشد و نسبت به بعضي مواد مانند آگار(عصاره يک جلبک) که ژل کدر و مات توليد مي کند، اين مزيت را دارد که ژل توليد شده از آن شفاف مي باشد. شفافيت محيط کشت باعث سهولت مشاهده آلودگي و نمو ريشه مي شود (فارسي و ذوالعلي، 1388).
بعد از ايجاد و استقرار کشت هاي استريل، بايد نسبت به افزايش تعداد نوساقه ها اقدام نماييم. در بعضي گونه ها ريزنمونه ها ممکن است که در روي محيط کشت ساده ريشه دار شوند که در اين صورت آنها بعنوان ريزقلمه محسوب خواهند شد. در صورتيکه هدف توليد بسيار زيادي گياه از هر ريزنمونه باشد، نه فقط تعداد محدودي گياه ريشه دار، اين موضوع از ارزش کمي برخوردار خواهد بود. بعضي گونه ها بدون هيچگونه تيماري تعداد زيادي نوساقه توليد مي کنند، در اينگونه موارد نياز به محيط هاي کشت تکثير کامل تر به ميزان تکثير بدست آمده يا مورد علاقه بستگي دارد (فارسي و ذوالعلي، 1388).
[1].Fire blight



دریافت فایل
جهت کپی مطلب از ctrl+A استفاده نمایید نماید




پروتکل ریز ازدیادی


تولید نیمه انبوه دو پایه


پا کوتاه کننده گلابی


دانلودپایان نامه


word


مقاله


پاورپوینت


فایل فلش


کارآموزی


گزارش تخصصی


اقدام پژوهی


درس پژوهی


جزوه


خلاصه


پاورپوینت بازاريابي و مديريت بازار

مقاله درباره ‌آثارکانی ها و سنگ ها در تأمین انرژی

تحقیق درباره پيمان با يهود و كارشكنى آنها 14 ص

پایان نامه ازدواج و تابعیت زن ایرانی 30 ص

پروژه حسابرسی

تحقیق درمورد همسر گزینی پیامبر و شیوه رفتار با

قرآن معجزه

پایان نامه ارشد بررسی رابطه بین دستکاری فعالیت

مقاله درباره ابو موسی جابر بن حیان

دانلود کتاب Foundations of Python Network Programming